Prospettive terapeutiche per la celiachia: nanovaccino all’orizzonte

Le prolamine sono proteine vegetali presenti nei semi di molti cereali utili all’accumulo di materiale nutritizio nell’endosperma (Fig. 1).

Se ne trovano nel grano (Triticum aestivum), nella segale (Secale cereale), nell’orzo (Hordeum vulgare), nell’avena (Avena sativa), nel mais (Zea mais), nel riso (Oryza sativa), nel miglio (Panicum miliarum), nel kamut (Triticum turgidum spp. Turanicum) noto anche come grano Khorasan, nel sorgo ((Sorgum vulgare), nella spelta (Triticum spelta, Fig. 2), nel Triticale (ibrido di Triticum e Segale), nel farro (Triticum dicoccum) ed assumono nomi comuni pittosto noti come: gliadine, secaline, avenine, zeine, orizine, cafirine.

Le gliadine (Fig. 3), ad esempio, sono proteine monomeriche, costituenti del glutine del peso molecolare di circa 30.000 dalton codificate da loci polimorfici siti sul cromosoma 1 e 6 dei vegetali che le posseggono ciascuno dei quali contiene molti geni linked, un buon numero dei quali ha, per di più, subito duplicazioni nel corso dell’evoluzione. Si tratta perciò di proteine altamente polimorfiche con centinaia di molecole note, tutte differenti fra di loro. La situazione è ulteriormente complicata (nel grano) da un patrimonio genico esaploide in cui sono estremamente frequenti le mutazioni. Ad ogni modo tutte le proteine in questione sono costituite da circa un 14% di prolina ed un 40% di glutamina. Nel Triticum aestivum L. sono state identificate classi di gliadine a, b, g, w1.2 edω-5, qui disposte in ordine di allergenicità crescente, in grado di riconoscere specificamente Anticorpi IgE [1].

In sostanza attualmente si conoscono quattro famiglie di gliadine caratterizzate secondo la loro mobilità su gel in a, b, g ed wdistribuite in 30 bande (identificazione elettroforetica) il cui peso molecolare varia dai 74.500 ai 6.500 dalton. Le bande sono variamente distribuite e presenti o asssenti in relazione alle varietà di grani considerati. Nel caso della famiglia w è possibile reperire sino a 16 bande. Tralasciando il discorso dell’esistenza di bande momomorfiche e polimorfiche, sembra comunque che sia significativo il maggior contenuto quantitativo di bande g ed  wnella determinazione della qualità del glutine tra di loro proporzionalmente correlati [2].

Gliadine della famiglia a sono presenti nella segale e nell’orzo. Nell’orzo le gliadine sono specificamente note come Ordeine, costituiscono il 40-50%  delle proteine totali del seme di orzo e ne esistono cinque gruppi A [3], B (da B1 a B28), C (da C1 a C16), D (D1, D2, D3, D4 e D5) e g (g1, g2, g3) [4]. In ciascun gruppo sono presenti molte bande a differenti pesi molecolari identificate con SDS-PAGE [5]. Le ordeine prodotte dall’orzo presentano una situazione meno complessa di quella del grano esaploide, dato che l’orzo è diploide. Tuttavia il genotipo dell’ endosperma è determinato da 3 cromosomi omologhi derivanti dalla doppia fertilizzazione della cellula femminile diploide (2n) da parte di due nuclei aploidi maschili (n). Sebbene i geni che controllano la sintesi delle ordeine siano famiglie multigeniche in cluster (es. Hor1 per le ordeine B e Hor2 per le ordeine C) situate sul braccio corto del cromosoma 5, molto meno abbondante è il linkage dei geni rispetto a quelli del grano [6].

Nel caso della segale le prolamine prodotte sono distinguibili in classi HMW (ad alto peso molecolare, con almeno due sottaclassi, codificate da geni strutturali del braccio lungo del cromosoma 1R),  w (40 kDa) e g (g40 di kDa e 2 molecole g75 da kDa, codificate da geni strutturali del braccio corto del cromosoma 1R), tutte immunogene, alle quali si aggiungono due piccole glicoproteine  di 15 kDa e 18 kDa anch’esse immunogene [7].

Delle zeine, contenute nel mais, si conoscono zeine a, la classe più abbondante (comprendente 2 sottoclassi di p.m. 19-22 e 22-24 kDa ed almeno 20 molecole diverse) ed eterogena, zeine b, ge d, che nel loro insieme costituiscono come minimo il 50% delleproteine dell’endosperma del seme [8]. La porzione centrale delle molecole delle zeine  presenta un dominio centrale di circa 20 aminoacidi ripetuto 6 o 7 volte. All’elettroforesi è possibile separare almeno 5 classi di zeine (H1, H2, L1, L2, L3)  in base al loro peso molecolare con ulteriori classificazioni per la possibilità di distinguere catene leggere e pesanti; i pesi variano tra 27.000 e 21.600. La variabilità molecolare è particolarmente elevata [9]. Anche le zeine sono prolamine ricche in genere di prolina,glutamina, leucina e alanina [10]i cui geni sono stati mappati sui cromosomi 4 e 10 [11]. E’ da notare che le prolamine di segale, orzo e grano sono cross-reattive [12].

Le poche righe appena scritte sono già di per sè sufficienti a chiarire quanto possa essere complesso lo studio di queste molecole che entrando nell’apparato digerente subiscono un processo di digestione che le  rompe in frammenti ciascuno diverso dall’altro. Per di più si calcola, secondo ricerche predittive, che possano esistere alcune centinaia di peptidi ‘tossici’ derivanti dalla digestione del glutine e almeno una cinquantina di epitopi siano importanti per l’attivazione della risposta immune nei casi di celiachia.

E’ un fatto che la comune e normale ingestione del glutine di cui le prolamine sono costituenti pone rischi rilevanti per la salute delle persone affette da malattia celiaca, che, se una volta veniva considerata una rarità, si è rivelata oggi assai frequente e capace di danneggiare non solo l’apparato digerente, ma molti altri sistemi dell’organismo.

La ricerca si è particolarmente applicata nello studio delle reazioni avverse causate dai frammenti ottenuti, dopo digestione, dalle gliadine: tra questi il più noto è il frammento proteasi-resistente a gliadina 33mer costituito da 33 aminoacidi (a2gliadina 56-88). La sua sequenza aminoacidica è LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (L= leucina, Q= glutamina; P= prolina, F= fenilalanina,.Y= tirosina). Dopo deamidazione il frammento 33mer cambia sequenza: LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF per sostituzione della glutamina con acido glutammico (E) e contiene più epitopi sovrapposte. Le epitopi sono sequenze aminoacidiche di 9 aminoacidi (frammenti 9mer) identificabili con metodiche complesse (dopo digestione artificiale del glutine) che usano ad esempio la HPLC-MS utile anche alla ricerca di frammenti immunogeni nei cibi [13]. Naturalmente le epitopi citate si ritrovano anche in altri frammenti di differenti lunghezze derivati dalla digestione del glutine: alcuni sono ad esempio frammenti 11mer. Uno di questi (Fig. 4) è caratterizzato dalla sequenza PFPQPQLPYPQ (a-gliadina 60-70) e la sua immunogenicità diviene ottimale quando al terminale N e C si aggiungano rispettivamente il tripeptide QLQ ed il tripeptide PQS (a-gliadina 57-73) e Q65, cioè la glutamina in posizione 65, venga sostituita dalla transglutamidasi con acido glutammico.

Il suffisso mer, dal greco μέρος  preceduto da un numero, indica, per chi non lo sapesse, il numero di residui aminoacidici nella sequenza peptidica. Il fatto che spesso si parli frammenti 33mer non esclude naturalmente altri frammenti di differenti dimensioni 7mer, 8mer, 10mer, 11mer, 13mer ecc.

Il fatto che dalla digestione del complesso di materiale proteinaceo del glutine derivino, frammenti proteici di varie dimensioni e che nei frammenti resistenti alla digestione siano presenti particolari epitopi spiega la risposta immunitaria del celiaco. In soggetti sani i frammenti di maggiori dimensioni non supererebbero la barriera della mucosa intestinale, ma nei celiaci sono sovraespresse le zonuline (ZOT = Zonula Occludens Toxins), ormoni in grado di interferire con le giunzioni strette della mucosa intestinale. Il contatto gliadina- recettore della zonulina determina il rilascio di zonulina che, riarrangiando il citoscheletro cellulare, incrementa la permeabilità delle giunzioni strette e permette il passaggio paracellulare (tra una cellula e l’altra) di materiali di discrete dimensioni [14]. L’ingresso di frammenti ‘tossici’, non digeribili, derivati dalla gliadina attiva la Transamidasi 2 tissutale (TG2, Fig. 5) che li deamida (conversione di funzioni amidiche in funzioni carbossiliche) in siti particolari in cui sono localizzati i residui aminoacidici della glutamina che vengono convertiti in residui di acido glutammico [15]. L’enzima è presente non solo nelle cellule della mucosa intestinale, ma anche ed in abbondanza, extracellularmente al di sotto dell’epitelio.

Premesso che molti peptidi ‘tossici’ possono, di per sè, senza problemi stimolare l’attività linfocitaria, la deamidazione aumentando le cariche negative delle epitopi ne incrementa fortemente la capacità di legame [16]. La posizione di residui di glutamina e di prolina nei peptidi influenza l’attività della TG2 nel senso che l’enzima predilige, per la deamidazione, alcune sequenze aminoacidiche piuttosto che altre [15]. E’ a questo punto che entra in campo il patrimonio genico del celiaco. La malattia è strettamente associata al genotipo DQ2 (HLA, II classe) costituito dai due alleli DQA*05 e DQB1*02; questo è il genotipo che ricorre in oltre il 90% dei casi di celiachia. In un alto 5% di casi il genotipo ricorrente è il DQ8, costituito dai due alleli DQA1*03 e DQB1*0302 [17].

In condizioni non patologiche il TCR (T cell receptor) dei linfociti T è in grado di riconoscere gli antigeni presentati dall’MHC cioè dal Complesso Maggiore di Istocompatibilità, noto come HLA negli umani . Il legame del TCR con il complesso MHC-antigene agisce sul linfocita T che dovrà poi essere pienamente attivato mediante amplificazione del segnale.

L’amplificazione del segnale avviene ad opera di ulteriori stimoli provenienti da specifici recettori quali il CD4 ed il CD8. Il co-recettore CD4 (presente sui linfociti, ma anche su macrofagi, granulociti e neuroni) lega, in particolare, regioni MHC di classe II. Le molecole DQ2 e DQ8, che sono per l’appunto molecole dell’HLA di classe II,  legano preferenzialmente, con legami H, in specifiche sedi di ancoraggio, frammenti a carica negativa (Fig. 6).

Le tasche di ancoraggio dei peptidi (Fig. 4) sono parzialmente costituite da residui aminoacidici variabili per l’elevato polimorfismo che caratterizza il sistema HLA e sono esattamente 9 i residui che offrono punti  ancora (posizioni 1, 4, 6, 7, 9) ai peptidi. Le molecole HLA di classe II, diversamente da quelle di classe I, possiedono tasche aperte che consentono l’ancoraggio di peptidi di varie lunghezze.

Nel celiaco le epitopi presenti nei polipeptidi derivati dalla digestione del glutine vengono presentate dalle cellule APC (Antigen-presenting cells, usualmente macrofagi e cellule dendritiche) ai linfociti in forma deamidata e dunque in grado di attivare assai efficacemente le cellule CD4+ (presenti sia come cellule intraepiteliali che nella lamina propria della mucosa intestinale) le quali a seconda del segnale ricevuto dalle APC rispondono proliferando in sottotipi vari: Th1 (T helper 1) che stimolano la proliferazione dei linfociti B attivati, Th2 (T helper 2) che attivano i linfociti B e permettono la successiva differenziazione in plasmacellule, Th17 (T helper 17) che secernono Il17 implicata nei processi di ipersensibilità e Treg (T regolatrici) che hanno il compito di ridurre la risposta immunitaria grazie a recettori altamente specifici in grado si legare IL1 e di sottrarla ai Th1 che di questa interleuchina subiscono la stimolazione. Il problema è che nei celiaci le cellule Treg ed in particolare le CD4+CD25+FoxP3+ sono inibite (Fig. 7), nelle loro funzioni, da un’esagerata produzione di IL15 [18].

Se l’antigene è presentato dai macrofagi l’attività proliferativa riguarda essenzialmente i Th1, le cellule dendritiche possono attivare invece vari pathway con proliferazione di tipi linfocitari diversi faciliando ad esempio la risposta dei Th1 o quella dei Th2. In ambo i casi vengono prodotte citochine infiammatorie (IL 18 e IFN a) e viene stimolata la risposta dei linfociti B con produzione di anticorpi che, nel caso della celiachia sono autoanticorpi (Fig. 7).

La reazione infiammatoria e quella autoimmunitaria portano alla distruzione della normale architettura della mucosa intestinale con perdita di capacità di assorbimento. E’ sufficiente la cronica ingestione di 50 mg di glutine per determinare danni permanenti alla mucosa intestinale e si tratta di una quantità ridottissima di glutine corrispondente più o meno alla centesima parte di una fetta di pane.

Tralasciamo per quanto riguarda la patogenesi della malattia la possibilità di collegamenti con infezioni virali, il coinvolgimento di altri geni quali il CTLA4, il ruolo delle metalloproteinasi nella degradazione della matrice tessutale nel cui assemblamento assume un ruolo importante proprio la  TG2, l’attivazione, dose dipendente della TG2 extracellulare ad opera dell’IFN-g.

In questo quadro, se pur non completo, ma già così complesso, quali sono le possibili prospettive terapeutiche della malattia celiaca?
Le azioni possibili riguardano l’assoluto allontanamento del glutine dalla dieta ed è questa oggi l’unica terapia possibile.
Una via teoricamente percorribile è quella della riduzione di permeabilità paracellulare della barriera intestinale, agendo sulla sovraespressione delle zonuline ed impedendo così il passaggio dei frammenti tossici al di sotto dell’epitelio della mucosa.
D’altro canto si potrebbe pensare alla somministazione di enzimi ad attività glutinasica, di origine naturale o sintetica, in grado di degradare le epitopi più lunghe e ridurne le dimensioni sino a portare la sequenza aminoacidica ad un numero di residui aminoacidici inferiori ad 8. Si parlerebbe in questo caso di farmaci somministrabili per via orale, opportunamente incapsulati per garantirne l’arrivo nell’intestino in stato di integrità, che avrebbero il compito di completare efficacemente la digestione delle sequenze tossiche o di un pretrattamento dei cibi con enzimi in grado di distruggere le sequenze tossicho o, ancora, in un quadro assai più ambizioso fornire l’epitelio intestinale del celiaco del gene della glutinasi utilizzando per l’appunto la terapia genica. Ovviamente sarebbe ugualmente utile ingegnerizzare batteri in grado di produrre glutinasi e di colonizzare transientemente o meglio ancora permanentemente l’intestino del celiaco. Un recente brevetto prevede l’uso ad esempio della propil-endopeptidasi in grado di danneggiare i motivi ripetuti ricchi di prolina (PXP) nei peptidi [19]. L’enzima è estraibile dal Flavobacterium meningosepticum un saprofita Gram negativo, aerobio facoltativo, che per essere un patogeno opportunista, lo è raramente per l’uomo, presente nelle acque e nei suoli o, anche, ma è solo un esempio, dalla comune carota [20]. Varie glutinasi possono comunque avere origine oltre che dal mondo dei batteri (Regno dei Monera) anche da quello vegetale o animale.
Un’ulteriore soluzione è quella della possibilità di bloccare l’attività della transdeamidasi (TG2) spesso indicata con il nome di trasdeaminasi [vedi Nota]; è però una via difficile da percorrere per l’importanza dell’enzima che non ha la sola ed esclusiva funzione di deamidazione.

Un’alternativa è l’intervento sulla reattività del sistema immunitario seguendo due differenti opzioni: o indurre direttamente la repressione delle cellule coinvolte nella risposta autoimmunitaria o stimolando cellule immunitarie in grado di bloccare naturalmente per via endogena la risposta immune. Sostanzialmente, in quest’ultimo caso, si dovrebbe restaurare la normale risposta di tolleranza intestinale per antigeni introdotti per via orale.La tolleranza orale è un fenomeno complesso che dipende anche dalla dose di esposizione a ciò che deve essere tollerato. In genere ridotte quantità di antigene inducono cellule Th2 (secrezione di IL4 e/o IL10) o Th3 (secrezione di TGF-b) che hanno funzioni regolatorie, mentre dosi elevate inducono delezione o anergia dei cloni cellulari reattivi Th1 e Th2 [21]. Il meccanismo della tolleranza orale potrebbe essere alterato nei celiaci specie dopo deamidazione dei frammenti tossici. Di fatto sembra che le cellule Treg (CD25+CD4+), cellule regolatrici coinvolte nel controllo dell’immunità delle mucose, siano nei celiaci inibite da elevati livelli di IL15 e non possano perciò svolgere la loro funzione regolatrice della risposta immunitaria [18]. Le cellule regolatrici Treg in condizioni di normalità sono.in grado inibire le cellule Th1 e Th2, le Th17 le cellule Natural Killer (NK) e probabilmente anche i linfociti citotossici; per queste loro abilità sarebbero perciò stesso in grado di sopprimere (bloccando il ciclo cellulare o inducendo apoptosi) le risposte nelle cellule bersaglio che abbiamo appena elencato [22] e di disinnescare le risposte immunitarie sia umorali che cellulari. Abbondanti, nell’intestino sono generalmente le cellule regolatrici Tr1 e Th3:

La somministrazione di complessi HLA-peptidi idrosolubili potrebbe direttamente indurre in apoptosi le cellule immunitarie reattive; anche questa via sembra particolarmente difficile da seguire per la molteplicità dei complessi che dovrebbero essere somministrati. Soluzione permanente sarebbe lo sviluppo di un vaccino diretto non contro microorganismi patogeni come verrebbe istintivo pensare, ma contro un materiale proteico che è parte naturale della dieta di persone sane. In quest’ultimo campo è già in corso di sperimentazione un nanovaccino che dopo aver superato la fase preclinica ha iniziato e praticamente completato la I fase del trial. Si tratta del Nexvax2®, dell’Immusan T, una compagnia di Cambridge che si occupa di biotecnologie e che affonda le sue radici scientifiche nelle ricerche del The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research (WEHI) di Melbourne, in Australia e della University di Oxford, in USA. La produzione del vaccino, si basa su un brevetto [23]dell’Immunan T. La metodica descritta nel brevetto è particolarmente complessa. Sono state inizialmente identificate le principali sequenze immunogeniche (valutando anche le conseguenze  della modificazione delle sequenze aminoacidiche mediante sostituzione di uno o più aminoacidi, sull’immunogenicità delle stesse) , tre di queste sono state scelte per la loro immunodominanza. Il primo peptide presenta la sequenza aminoacidica LQPFPQPELPYPQPQ, nel secondo la sequenza è QPFPQPEQPFPWQP, nel terzo è invece PEQPIPEQPQPYPQQ. Ciascuno di questi polipeptidi, preferenzialmente provvisto di gruppi piroglutammato e amide rispettivamente con N e C terminale, contiene 2 differenti epitopi sovrapposte per un totale di 6 epitopi. E’ ovviamente possibile a seconda dei vari tipi di allestimento, ed è stato fatto, anche incrementare il numero dei polipeptidi quasi una settantina, costituiti da sequenze aminoacidiche differenti contenenti differenti tipi di epitopi sia in forma naturale che in forma deamidata. L’idrosolubilità dei peptidi è altresì importante affinchè possa stabilirsene la tolleranza ed al tempo stesso previene o quanto meno minimizza il rischio di reazioni anafilattiche, specie se le molecole sono di limitata lunghezza. E’ ben noto che un antigene solubile è assai più tollerogenico di un antigene insolubile o particolato. Fermo restando che i primi tre peptidi di cui abbiamo indicato la sequenza sono quelli essenziali, l’incremento del numero di peptidi utilizzati consente una protezione molto ampia, commisurata alla varietà di peptidi introdotti con la dieta. Il vaccino è costituito  dai tre principali peptidi ‘tossici’ sopra nominati in associazione eventualmente ad altri peptidi o loro varianti in presenza di un adiuvante (paradossalmente un buon immunogeno coadiuvato da un adiuvante, favorisce l’induzione della tolleranza) e di un carrier adatto (potrebbe trattarsi anche di un liposoma). Molte sono le possibili formulazioni farmaceutiche del vaccino: compresse sciroppi, forme iniettabili, polveri, granuli, sospensioni acquose o oleose ed infine formulazioni a lento rilascio che richiederebbero matrici tutt’affatto particolari che comportano l’uso di liposomi o ancora, ad esempio, di nanoparticelle o nanogabbie.

Che cosa succede quando il vaccino venga somministrato per via sottocutanea?

Alla prima somministrazione delle sequenze tossiche si assiste ad un incremento del numero di cellule T reattive contro queste stesse sequenze sia nella milza che nei linfonodi mesenterici dell’intestino ed in quelli che raccolgono la linfa dalla sede di iniezione (linfonodi poplitei, stiamo in questo caso parlando delle zampe di topi transgenici Black-6 inizialmente utilizzati nella sperimentazione). Con la ripetuta somministrazione di Nexvax2 il numero di cellule Cd4+ reattive alla gliadina si riduce mentre aumenta il numero di cellule Treg (cellule regolatrici che deprimono la risposta immune) con aumento di cellule in grado di produrre IFNg ed IL10. La capacità proliferativa delle cellule reattive alla gliadina si riduce e viene infine soppressa, può però essere restaurata dalla somministrazione di IL2. Più dettagliatamente il trattamento con peptidi tossici determina l’induzione di tolleanza periferica con induzione di cellule regolatrici (Treg)  CD4+CD25+FoxP3+  in grado di agire contro le cellule reattive per la gliadina e di indurle, dopo ripetute somministrazioni all’anergia. L’induzione delle Treg citate è proporzionale alla dose somministrata; nel caso del topo la dose massima è di 10 mg per ciascun peptide.

Allo scopo di valutare sicurezza, tollerabilità e bioattività del Nervax2 per applicazioni terapeutiche umane, il vaccino è stato saggiato su volontari celiaci che seguivano rigorosamente una dieta priva con, pare, risultati favorevoli per circa 1 mese  [24]. I pazienti in trial sono stati suddivisi in 3 gruppi ciascuno di 10 persone a cui veniva iniettato per via intradermicaa vaccino in vari dosaggi. Erano presenti per ogni gruppo soggetti a cui veniva somministrato placebo. Un primo gruppo era trattato con 9 mg di peptidi un secondo gruppo era iniettato con dosi da 30 mg che salivano a 90 nel caso del terzo gruppo. La somministrazione di vaccino ripetuta per 3 volte durante le prime tre settimane (alle ore 8 del 1° , 8° e 15° giorno) era seguita dalla somministrazione dopo quattro ore di un pasto privo di glutine. Solamente nei giorni successivi (20°, 21° e 22° giorno di trial) i ricercatori hanno provveduto ad una doppia somministrazione di glutine (alle ore 8 ed alle ore 12). I pazienti sono stati seguiti per 25 giorni e solo in alcuni che venivano iniettati con il dosaggio più elevato si sono manifestati sintomi gastro-intestinali simili a quelli che si hanno comunemente nei celiaci che ingeriscano glutine. Ci si attende l’avvio della Seconda Fase del trial nell’arco del 2012.

Sulla stessa base delle conoscenze acquisite durante la messa a punto del brevetto l’INOVA Diagnostics si occuperà dello sviluppo di un test clinico che permetta la diagnosi di malattia celiaca basata sull’identificazione di cellule T-reattive per le sequenze tossiche del glutine onde poter evitare un metodo diagnostico invasivo quale la biopsia intestinale che è ancora oggi il ‘gold standard’ per il defnitivo accertamento della malattia celiaca.

 

[Nota] Spesso quando si parla di celiachia anziché parlare di Transdeamidasi, si usa oggi il termine Transdeaminasi. La transdeamidasi è a tutti gli effetti membro della famiglia delle Transglutaminasi, enzimi ad attività multifunzionali in grado di contribuire all’assemblaggio di strutture in cui i crosslink presenti sono basati su legami covalenti. La deamidazione è una delle funzioni della transdeamidasi.

 

Il lavoro completo di figure sarà reperibile nel Gruppo Nanoscienze e medicina.

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